紫外-可见吸收光谱法，亦称紫外-可见分光光度法，是一种分析技术，主要用于研究分子在190nm至750nm波长范围内的光吸收行为。这种方法基于溶液中物质分子对特定波长光的选择性吸收。分子的外层价电子跃迁产生了紫外-可见吸收光谱，这些吸收光谱通常呈现为带光谱。

实验目的

1. 学习紫外分光光度法测定生物样品中蛋白质含量的原理；

2. 掌握紫外分光光度法的实验技术；

3. 熟悉UV-1700PC紫外-可见分光光度计的操作方法及主要构造。

实验原理

紫外-可见吸收光谱法基于分子对特定波长光的选择性吸收，通过外层价电子的跃迁而形成相应的吸收光谱。定性分析通常采用光谱比较法，将未知样品与已知样品的吸光特征进行比较；而定量分析依赖于朗伯-比尔定律：A=lg(I0/I)=εbc。在一定的浓度范围内，物质的吸光度与其浓度呈线性关系。最大吸收波长处的摩尔吸收系数最高，因此通常测量此波长的吸光度以获得最佳灵敏度。

在光度分析中，将空白溶液和待测溶液放入两个厚度为b的吸收池中，利用平行单色光照射样品，并根据测得的透光强度计算吸光度。紫外-可见分光光度计的主要组成部分包括光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示器。

蛋白质含量的测定

本实验采用紫外分光光度法测定生物样品中蛋白质含量的原理如下：

1. 蛋白质中酪氨酸和色氨酸的氨基酸残基含有共轭双键，因此其在275-280nm范围内具有显著的紫外吸收。在一定的浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。该方法适用于浓度范围为0.1-10mg/mL的蛋白质分析。

2. 然而不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量不同，光吸收特征也会有所差异，因此可能导致测量准确度降低。

3. 在样品中如果有嘌呤或嘧啶等核酸类物质，可能在280nm的测量中产生显著干扰。核酸在260nm的光吸收比280nm更强，因此可利用480nm和260nm的吸光度差进行蛋白质含量计算，通常使用的公式为：蛋白质浓度（mg/mL）= 145*A280 - 0.74*A260。

4. 对于稀溶液中的蛋白质浓度测定，可以选用215nm和225nm波长之间的光吸收差值进行计算，常用公式为：蛋白质浓度（mg/mL）= 0.144*(A215 - A225)。

实验设备与试剂

仪器：UV-1700PC紫外-可见分光光度计，5个10ml比色管，吸量管。

试剂：标准蛋白质溶液（300mg/mL）、0.9% NaCl溶液，以及待测生物样品溶液。

实验步骤

准备工作

1. 启动计算机及仪器并初始化。

2. 在工作界面选择光度测量项目，并设置测量条件。

3. 放入空白溶液进行零点校正。

4. 制作标准曲线。

测量工作

1. 以0.9% NaCl溶液稀释标准蛋白质溶液，并测量在190nm至400nm区间的吸光度。

2. 制作标准曲线，记录各标准溶液在280nm处的吸光度。

3. 测定待测溶液的吸光度，并进行平行测定。

数据处理

1. 根据波长与吸光度绘制吸收曲线，找出最大吸收波长λmax。

2. 绘制标准曲线，计算获得的蛋白质平均浓度和标准偏差，会形成有效的结果供分析参考。

通过以上步骤和方法，能够准确测定生物样品中的蛋白质含量。此外，品牌俄罗斯专享会294为生物医疗研究提供了高质量的实验设备和试剂，帮助科研人员获得精确的数据分析结果。